端粒酶是一種核糖核蛋白復合物，包含催化DNA延伸的內源性RNA模板，在大多數人類(lèi)癌癥中表達上調，是一種重要的腫瘤標志物。另一方面，特定微小核糖核酸（miRNA）的異常表達也與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)。因此，端粒酶與miRNA的聯(lián)合檢測分析在臨床診斷、生物醫學(xué)研究和抗癌藥物篩選等方面具有重要的研究?jì)r(jià)值。目前，常規檢測方法這兩類(lèi)分子的方法主要是端粒重復序列擴增技術(shù)(telomerase repeat amplification protocol, TRAP)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。然而，這兩種技術(shù)很難進(jìn)行直接的整合。實(shí)現端粒酶與miRNA同步高靈敏分析仍然存在很大的挑戰。

　　近期，蘇州醫工所繆鵬研究員課題組發(fā)展了一種基于銀納米簇(silver nanoclusters, AgNCs)的熒光邏輯門(mén)體系，用于同時(shí)檢測端粒酶與miRNA。其檢測原理如圖1所示，首先設計用于雜交鏈式反應的發(fā)夾結構DNA探針H1和H2。H1用于捕獲觸發(fā)鏈和打開(kāi)H2的發(fā)夾結構。由于H2的3’端含有合成AgNCs的模板序列，可以通過(guò)引入Ag⁺與特定還原劑來(lái)原位合成AgNCs，利用其發(fā)射的明亮熒光作為輸出信號。初始狀態(tài)下，H2-AgNCs吸附于氧化石墨烯表面，其熒光處于淬滅狀態(tài)。另一方面，H0_OR和H0_AND序列分別參與“或”門(mén)和“與”門(mén)的邏輯運算。它們的序列中都包含可以觸發(fā)H1和H2之間雜交鏈式反應的序列。當端粒酶與miRNA作為信號輸入引發(fā)相應邏輯門(mén)的反應后，能夠起始雜交鏈式反應。該反應形成的長(cháng)雙鏈產(chǎn)物可以從氧化石墨烯表面釋放出來(lái)，利用AgNCs恢復的熒光作為輸出信號來(lái)指示目標輸入的信息。

　　圖1. 基于AgNCs和雜交鏈式反應的熒光邏輯門(mén)檢測miRNA和端粒酶示意圖

　　通過(guò)定量分析，miRNA和端粒酶的檢測限分別為2.8 pM和2 cells。“或”門(mén)能夠在兩種輸入分子任意存在的情況下得到明亮的熒光信號輸出。“與”門(mén)只有在miRNA和端粒酶共同存在的情況下才能夠輸出較強的熒光信號。在本工作中，氧化石墨烯不僅作為熒光淬滅劑，我們也可以利用其將熒光邏輯門(mén)體系轉運至細胞內，來(lái)觀(guān)察細胞內端粒酶與特定miRNA的表達情況（圖2）。本工作中發(fā)展的熒光邏輯門(mén)具有成本低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現了對兩種腫瘤標志物的同時(shí)檢測，能夠可以有效提高相關(guān)疾病的診斷準確性。

　　本工作得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃(2017YFE0132300)等項目的資助，結果已發(fā)表Nanoscale, 2022, 14, 612–616 (IF=7.79) 

　　論文鏈接: https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/NR/D1NR05622K 

　　圖2. HeLa細胞在連續添加氧化石墨烯@AgNCs、輔助鏈和端粒酶抑制劑后的邏輯門(mén)共聚焦圖像